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端粒酶活性

1 拼音

duān lì méi huó xìng

2 英文参考

Telomerase activity

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3 概述

端粒真核生物染色体末端的一种特殊结构,由一富含鸟嘌呤的重复DNA序列及其相关蛋白组成。端粒是保护染色体末端稳定必不可少的结构。端粒长度的维持需要端粒酶活性的存在。永生细胞肿瘤细胞能够长期生存,端粒酶起到了重要的作用。端粒酶是由RNA和蛋白体组成的复合体,属一种专一的依赖RNA的逆转录酶,能以自身的RNA为模板,从头合成染色体末端的端粒DNA,弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失,维持端粒的长度,保持染色体的动态平衡,使细胞获得永生化。自1994年Kim建立了高敏感度的、以PCR为基础的检测端粒酶的方法以来,端粒酶引起了人们的广泛关注。人们发现,端粒酶与细胞的增生、分化和不死性有着极为密切的关系,已成为目前肿瘤和衰老基础研究的热点之一。

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4 端粒酶活性的医学检查

4.1 检查名称

端粒酶活性

4.2 分类

血清学检查 > 肿瘤免疫检测

4.3 端粒酶活性的测定原理

聚合酶链反应技术:聚合酶链反应是在体外进行的由3个基本步骤组成的循环反应。第一步变性:将所有扩增的基因片段加热,使双链之间的氢键断裂,分解成两条单核苷酸链;第二步退火:当温度下降时,化学合成的寡聚核苷酸引物即与所要扩增基因两侧的DNA相合;第三步延伸:在合适缓冲液,即镁离子和4种脱氧核苷酸存在的条件下,DNA聚合酶能忠实地根据模板碱基序列合成互补链,从引物的3'端进行延伸,合成的方向为5'→3',从而合成与原来结构相同的基因片段2分子。3个步骤组成1个循环,每循环1次DNA分子数按指数倍增。

4.4 试剂

聚合酶链反应的基本条件包括纯化的DNA或RNA基因组,用于合成DNA的单核苷酸,寡聚核苷酸引物DNA聚合酶,各种缓冲液,快速改变温度的能力及专用检测系统

(2)DNA/RNA的抽提与纯化:同本节核酸探针技术中的DNA/RNA的抽提与纯化。

(2)引物的选择:首先要知道待扩增基因片段两侧DNA的序列,然后用化学合成法合成一对与两侧DNA序列互补的寡聚核苷酸为引物,长度一般为20~30核苷酸。引物的选择应注意下列几点:①其序列是所要扩增基因特异的;②碱基随机分布,避免成堆的嘌呤或嘧啶;③不会自体形成二级结构;④一对引物不应自身互补。

(3)DNA聚合酶:选用Taq-DNA聚合酶,它能耐高温,产量高,扩增长度可达10kb以上,加一次酶可进行不断循环。

4.5 操作方法

基因组DNA为0.1μg;缓冲液含50mmol/L氯化钾,10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),1.5mmol/L氯化镁,100μg明胶;每一引物为0.25μmol/L;dATP,dCTP,dGTP,dTIP各为200μmol/L;DNA聚合酶为2.5U,终体积为100μl。加数滴液体石蜡防止蒸发

反应周期:①变性:90℃ 30~60s;②引物和模板的退火温度:40~60℃ 30~60s;③延伸:72℃ 1~2min。经反复循环30~40次,最后1次72℃引物延伸7min后终止。除去液体石蜡后,产物可供分析。经琼脂凝胶电泳后,用溴乙锭染色,经紫外灯照射可见预料扩增长度的荧光条带。产物也可与放射标记或非放射标记的寡聚核苷酸探针行Southern印迹杂交或点渍印迹杂交。如用PCR自动仪则更为方便,将反应试剂、DNA模板及Taq-DNA聚合酶加入试管后,放进已调好程序,即所需变性→退火→延伸各自的温度和时间及循环次数的自动仪中进行反应,即可获得满意的扩增产物。

4.6 正常值

阴性

4.7 化验结果临床意义

(1)肝癌患者有较高的端粒酶阳性率(85%),端粒酶活性阳性者AFP水平明显高于端粒酶活性阴性者。端粒酶活性与肿瘤大小组织学分级及肿瘤转移无显著相关。端粒酶有可能成为诊断肝癌的肿瘤标志物

(2)端粒酶在大多数恶性肿瘤组织有较高水平表达,如神经母细胞瘤(94%)、乳腺癌(93%)、大肠癌(93%)、胃癌(85%)、前列腺癌(84%)、肺癌(80%)等。端粒酶活性与肿瘤的临床分期及预后密切相关。因此,端粒酶是目前最特异和具有普遍性的肿瘤标记物。

(3)在少数良性病变(如肝炎肝硬化、良性脑膜瘤等)组织中可有很弱的端粒酶活性。

4.8 附注

近年来,“端粒、端粒酶假说”已被越来越多的研究所证实,以端粒酶活性水平为肿瘤诊断的生物标志和预后指标。

4.9 相关疾病

神经母细胞瘤、乳腺癌、大肠癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、肝硬化、脑膜瘤

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