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Taq DNA聚合酶

1 拼音

Taq DNA jù hé méi

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2 注解

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌,能在70~75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长2496个碱基编码832个氨基酸,酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75~80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸,70℃延伸率大于60个核苷酸/秒,55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性,该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成, 但确有良好的热稳定性,在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃时,PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min,40min和5~6min后,仍可 保持50%的活性,实验表明.PCR反应时变性温度为95℃~20sec,50个循环后,Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件,也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性, 其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65~68℃,有Mn2 存在时,其逆转录活性 更高.

TaqDNA聚合酶是Mg2 依赖性酶,该酶的催化活性对Mg2 浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板,dNTP的浓度为0.7~0.8mmol/L时,用不同浓度Mg2 进行 PCR反应10min,测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高,此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性,Mg2 过高就抑制酶活性,当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制40~50%的酶活性.由于Mg2 能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2 浓度,因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整,优化浓度.一般反应 中Mg2 浓度至少应比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50~60%,其最适浓度为50mmol/L,高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性.

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