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2010年版药典一部附录Ⅴ

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn yī bù fù lù Ⅴ

《中中华人民共和国药典》2010年版一部 附录Ⅴ 分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度,对该物质进行定性定量分析方法。常用的波长范围为:(1) 200~400nm的紫外光区;(2)400~760nm的可见光区;(3) 760~2500nm的近红外光区;(4)2.5~25μm(按波数计为4000~400cm-1)的中红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量精密度准确度,所用仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定,定期进行校正检定。

色光辐射穿过被测物质溶液时,在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比,其关系如下式:

式中A为吸光度;T为透光率;E为吸收系数,采用的表示方法是,其物理意义为:当溶液浓度为1% (g/ml),液层厚度为1cm时的吸光度数值

c为100ml溶液中所含被测物质的重量(按干燥品或无水物计算),g;

l为液层厚度,cm。

物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液,测定其吸光度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区,除某些物质对光有吸收外,很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析

2 附录V A紫外-可见分光光度法

2.1 仪器的校正和检定

2.1.1 1.波长

由于环境因素对机械部分的影响,仪器的波长经常会略有变动,因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外,还应于测定前校正测定波长。常用汞灯中的较强谱线237.83nm, 253.65nm, 275.28nm, 296.73nm, 313.16nm,334.15nm, 365.02nm, 404.66nm, 435.83nm, 546.07nm与576.96nm;或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正;钬玻璃在波长279.4nm,287.5nm,333.7nm,360.9nm,418.5nm,460.0nm,484.5nm,536.2nm与637.5nm处有尖锐吸收峰,也可作波长校正用,但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化,使用时应注意;近年来,常使用高氯酸钬溶液校正双光束仪器,以10%高氯酸溶液为溶剂,配制含氧化钬(Ho2O3) 4%的溶液,该溶液的吸收峰波长为241.13nm, 278.10nm,、287.18nm,333.44nm,345.47nm,361.31nm,416.28nm,451.30nm,485.29nm,536.64nm和640.52nm。

仪器波长的允许误差为:紫外光区±1nm,500nm附近±2nm。

2.1.2 2.吸光度的准确度

可用重铬酸钾硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重基准重铬酸钾约60mg,精密称定,用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml,在规定的波长处测定并计算其吸收系数,并与规定的吸收系数比较,应符合表中的规定。

波长/nm

235(最小)

257(最大)

313(最小)

350(最大)

吸收系数()的规定值

124.5

144.0

48.6 .

106.6

吸收系数()的许可范围

123.0~126.0

142.8~146.2

47.0~50.3

105.5~108.5

2.1.3 3.杂散光检查

可按下表所列的试剂和浓度,配制成水溶液,置1cm石英吸收池中,在规定的波长处测定透光率,应符合表中的规定。

试剂

浓度/%(g/ml)

测定用波长/nm

透光率/%

碘化钠

1.00

220

<0.8

亚硝酸钠

5.00

340

<0.8

2.2 对溶剂的要求

含有杂原子的有机溶剂,通常均具有很强的末端吸收。因此,当作溶剂使用时,它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇乙醇的截止使用波长为205nm。另外,当溶剂不纯时,也可能增加干扰吸收。因此,在测定供试品前,应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求,即将溶剂置1cm石英吸收池中,以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度,在220~240nm范围内不得超过0.40,在241~250nm范围内不得超过0.20,在251~300nm范围内不得超过0.10,在300nm以上时不得超过0.05。

2.3 测定法

测定时,除另有规定外,应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照,采用1cm的石英吸收池,在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度,或由仪器在规定波长附近自动扫描测定,以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确。除另有规定外,吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内,并以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数,以在0.3~0.7之间为宜。仪器的狭缝波带宽度宜小于供试品吸收带的半高宽度的十分之一,否则测得的吸光度会偏低;狭缝宽度的选择,应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增大为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收,因此测定供试品的吸光度后应减去空白读数,或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。

当溶液的pH值对测定结果有影响时,应将供试品溶液的pH值和对照品溶液的pH值调成一致。

2.3.1 1.鉴别和检查

分别按各品种项下规定的方法进行。

2.3.2 2.含量测定

一般有以下几种方法。

2.3.2.1 (1)对照品比较法

按各品种项下的方法,分别配制供试品溶液和对照品溶液,对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%±10%,所用溶剂也应完全一致,在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后,按下式计算供试品中被测溶液的浓度

cx=(AX/AR)CR

式中 cx为供试品溶液的浓度;

Ax为供试品溶液的吸光度;

cR为对照品溶液的浓度;

AR为对照品溶液的吸光度。

2.3.2.2 (2)吸收系数法

按各品种项下的方法配制供试品溶液,在规定的波长处测定其吸光度,再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时,吸收系数通常应大于100,并注意仪器的校正和检定。

2.3.2.3 (3)计算分光光度法

计算分光光度法有多种,使用时应按各品种项下规定的方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时,波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响,故对照品和供试品的测试条件应尽可能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。

2.3.2.4 (4)比色法

供试品本身在紫外一可见光区没有强吸收,或在紫外光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度,可加入适当的显色剂,使反应产物的最大吸收移至可见光区,这种测定方法称为比色法。

用比色法测定时,由于显色时影响显色深浅的因素较多,应取供试品与对照品或标准品同时操作。除另有规定外,比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液,然后依次加入等量的相应试剂,并用同样方法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后,按上述(1)法计算供试品浓度。

当吸光度和浓度关系不呈良好线性时,应取数份梯度量的对照品溶液,用溶剂补充至同一体积,显色后测定各份溶液的吸光度,然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线,再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度,并求出其含量。

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3 附录V C红外分光光度法

3.1 仪器及其校正

可使用傅里叶变换红外光谱仪或色散型红外分光光度计。用聚苯乙烯薄膜(厚度约为0.04mm)校正仪器,绘制其光谱图,用3027cm-1,2851cm-1,1601cm-1,1028cm-1,907cm-1处的吸收峰对仪器的波数进行校正。傅里叶变换红外光谱仪在3000cm-1附近的波数误差应不大于±5cm-1,在1000cm-1附近的波数误差应不大于±1cm-1

用聚苯乙烯薄膜校正时,仪器的分辨率要求在3110~2850cm-1范围内应能清晰地分辨出7个峰,峰2851cm-1与谷2870cm-1之间的分辨深度不小于18%透光率,峰1583cm-1与谷1589cm-1之间的分辨深度不小于12%透光率。仪器的标称分辨率,除另有规定外,应不低于2cm-1

3.2 供试品的制备及测定

3.2.1 1.原料药鉴

除另有规定外,应按照国家药典委员会编订的《药品红外光谱集》各卷收载的各光谱图所规定的方法制备样品。具体操作技术参见《药品红外光谱集>的说明。采用固体制样技术时,最常碰到的问题是多晶现象,固体样品的晶型不同,其红外光谱往往也会产生差异。当供试品的实测光谱与《药品红外光谱集》所收载的标准光谱不一致时,在排除各种可能影响光谱的外在或人为因素后,应按该药品光谱图中备注的方法或各品种项下规定的方法进行预处理,再绘制光谱,比对。如未规定该品种供药用的晶型或预处理方法,则可使用对照品,并采用适当的溶剂对供试品与对照品在相同的条件下同时进行重结晶,然后依法绘制光谱,比对。如已规定特定的药用晶型,则应采用相应晶型的对照品依法比对。

当采用固体制样技术不能满足鉴别需要时,可改用溶液法绘制光谱后比对。

3.2.2 2.制剂鉴别

品种鉴别项下应明确规定制剂的前处理方法,通常采用溶剂提取法。提取时应选择适宜的溶剂,以尽可能减少辅料的干扰,并力求避免导致可能的晶型转变。提取的样品再经适当干燥后依法进行红外光谱鉴别。

3.2.3 3.多组分原料药鉴别

不能采用全光谱比对,可借鉴【注意事项】“2(3)”的方法,选择主要成分的若干个特征谱带,用于组成相对稳定的多组分原料药的鉴别。

3.2.4 4.晶型、异构体限度检查或含量测定

供试品制备和具体测定方法均按各品种项下有关规定操作。

3.3 注意事项

1.各品种项下规定“应与对照的图谱(光谱集××图)一致”,系指《药品红外光谱集》各卷所载的图谱。同一化合物的图谱若在不同卷上均有收载时,则以后卷所载的图谱为准。

2.药物制剂经提取处理并依法绘制光谱,比对时应注意以下四种情况:

(1)辅料无干扰,待测成分的晶型不变化,此时可直接与原料药的标准光谱进行比对;

(2)辅料无干扰,但待测成分的晶型有变化,此种情况可用对照品经同法处理后的光谱比对;

(3)待测成分的晶型不变化,而辅料存在不同程度的干扰,此时可参照原料药的标准光谱,在指纹区内选择3~5个不受辅料干扰的待测成分的特征谱带作为鉴别的依据。鉴别时,实测谱带的波数误差应小于规定值的0.5%;

(4)待测成分的晶型有变化,辅料也存在于扰,此种情况一般不宜采用红外光谱鉴别。

3.由于各种型号的仪器性能不同,供试品制备时研磨程度的差异或吸水程度不同等原因,均会影响光谱的形状。因此,进行光谱比对时,应考虑各种因素可能造成的影响。

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4 附录V D原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素,系由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生的原子蒸气时,被蒸气中待测元素的基态原子所吸收,通过测定辐射光强度减弱的程度,求出供试品中待测元素的含量。原子吸收分光光度法遵循分光光度法的吸收定律,一般通过比较对照品溶液和供试品溶液的吸光度,求得供试品中待测元素的含量。

4.1 对仪器的一般要求

所用仪器为原子吸收分光光度计,由光源、原子化器、单色器和检测系统等组成,另有背景校正系统、自动进样系统等。

4.1.1 1.光源

常用待测元素作为阴极的空心阴极灯。

4.1.2 2.原子化器

主要有四种类型:火焰原子化器、石墨炉原子化器、氢化物发生原子化器及冷蒸气发生原子化器。

4.1.2.1 (1)火焰原子化器

由雾化器及燃烧灯头等主要部件组成。其功能是将供试品溶液雾化成气溶胶后,再与燃气混合,进入燃烧灯头产生的火焰中,以干燥、蒸发、离解供试品,使待测元素形成基态原子。燃烧火焰由不同种类的气体混合物产生,常用乙炔-空气火焰。改变燃气和助燃气的种类及比例可以控制火焰的温度,以获得较好的火焰稳定性和测定灵敏度。

4.1.2.2 (2)石墨炉原子化器

由电热石墨炉及电源等部件组成。其功能是将供试品溶液干燥、灰化,再经高温原子化使待测元素形成基态原子。一般以石墨作为发热体,炉中通入保护气,以防氧化并能输送试样蒸气。

4.1.2.3 (3)氢化物发生原子化器

由氢化物发生器和原子吸收池组成,可用于砷、锗、铅、镉、硒、锡、锑等元素的测定。其功能是将待测元素在酸性介质中还原成低沸点、易受热分解的氢化物,再由载气导入由石英管、加热器等组成的原子吸收池,在吸收池中氢化物被加热分解,并形成基态原子。

4.1.2.4 (4)冷蒸气发生原子化器

由汞蒸气发生器和原子吸收池组成,专门用于汞的测定。其功能是将供试品溶液中的汞离子还原成游离汞,再由载气将汞蒸气导人石英原子吸收池,进行测定。

4.1.2.5 3.单色器

其功能是从光源发射的电磁辐射分离出所需要的电磁辐射,仪器光路应能保证有良好的光谱分辨率和在相当窄的光谱带(0.2nm)下正常工作的能力,波长范围一般为190.0~900.0nm。

4.1.2.6 4.检测系统

由检测器、信号处理器和指示记录器组成,应具有较高的灵敏度和较好的稳定性,并能及时跟踪吸收信号的急速变化。

4.1.2.7 5.背景校正系统

背景干扰是原子吸收测定中的常见现象。背景吸收通常来源于样品中的共存组分及其在原子化过程中形成的次生分子或原子的热发射、光吸收和光散射等。这些干扰在仪器设计时应设法予以克服。常用的背景校正法有连续光源(在紫外光区通常用氘灯)、塞曼效应、自吸效应等。

在原子吸收分光光度分析中,必须注意背景以及其他原因引起的对测定的干扰。仪器某些工作条件(如波长、狭缝、原子化条件等)的变化可影响灵敏度、稳定程度和干扰情况。在火焰法原子吸收测定中可采用选择适宜的测定谱线和狭缝、改变火焰温度、加入络合剂或释放剂、采用标准加入法等方法消除干扰;在石墨炉原子吸收测定中可采用选择适宜的背景校正系统、加入适宜的基体改进剂等方法消除干扰。具体方法应按各品种项下的规定选用。

4.2 测定法

4.2.1 第一法(标准曲线法)

在仪器推荐的浓度范围内,制备含待测元素的对照品溶液至少3份,浓度依次递增,并分别加入各品种项下制备供试品溶液的相应试剂,同时以相应试剂制备空白对照溶液。将仪器按规定启动后,依次测定空白对照溶液和各浓度对照品溶液的吸光度,记录读数。以每一浓度3次吸光度读数的平均值为纵坐标、相应浓度为横坐标,绘制标准曲线。按各品种项下的规定制备供试品溶液,使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内,测定吸光度,取3次读数的平均值,从标准曲线上查得相应的浓度,计算元素的含量。

4.2.2 第二法(标准加入法)

取同体积按各品种项下规定制备的供试品溶液4份,分别置4个同体积的量瓶中,除(1)号量瓶外,其他量瓶分别精密加入不同浓度的待测元素对照品溶液,分别用去离子水稀释至刻度,制成从零开始递增的一系列溶液。按上述标准曲线法自“将仪器按规定启动后”操作,测定吸光度,记录读数;将吸光度读数与相应的待测元素加入量作图,延长此直线至与含量轴的延长线相交,此交点与原点间的距离即相当于供试品溶液取用量中待测元素的含量(如图)。再以此计算供试品中待测元素的含量。此法仅适用于第一法标准曲线呈线性并通过原点的情况。

当用于杂质限度检查时,取供试品,按各品种项下的规定,制备供试品溶液;另取等量的供试品,加入限度量的待测元素溶液,制成对照品溶液。照上述标准曲线法操作,设对照品溶液的读数为a,供试品溶液的读数为b,b值应小于(a-b)。

图 标准加入法测定图示

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