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2010年版药典三部附录Ⅻ

目录

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅻ

中华人民共和国药典》(2010年版)三部附录Ⅻ

2 附录Ⅻ A 无菌检查法

无菌检查法系用于检查药典要求无菌生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染

无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识,并经过无菌技术的培训。

2.1 培养基

2.1.1 培养基的制备

培养基可按以下处方制备,亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境,若保存于非密闭容器中,一般可在3周内使用;若保存于密闭容器中,一般可在1年内使用。

1.硫乙醇酸盐流体培养基

酪胨(胰酶水解)    15.0g

酵母浸出粉    5.0g

葡萄糖    5.0g

氯化钠    2.5g

L-胱氨酸    0.5g

新配制的0.1%刃天青溶液    1.0ml

硫乙醇酸钠    0.5g (或硫乙醇酸) (0.3ml)

琼脂    0.75g

水    1000ml

除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微温溶解,调pH值为弱碱性,煮沸,滤清,加入葡萄糖和刃天青溶液,摇匀,调pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中,其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2,灭菌。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5,否则,须经100℃水浴加热至粉红色消失(不超过20分钟)后,迅速冷却,只限加热1次,并防止被污染。

2.改良马丁培养基

胨    5.0g

磷酸氢二钾    1.0g

酵母浸出粉  2.0g

硫酸镁    0.5g

葡萄糖    20.0g

水    1000ml

除葡萄糖外,取上述成分混合,微温溶解,调pH值约为6.8,煮沸;加入葡萄糖溶解后,摇匀,滤清,调pH值使灭菌后为6.4±0.2,分装,灭菌。

3.选择性培养基

按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法,在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂灭活剂或表面活性剂,其用量同方法验证试验。

4.营养肉汤培养基

胨    10.0g

氯化钠    5.0g

牛肉浸出粉  3.0g

水    1000ml

取上述成分混合,微温溶解,调pH值为弱碱性,煮沸,滤清,调pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

5.营养琼脂培养基

按上述营养肉汤培养基的处方及制法,加入14.0g琼脂,调pH值使灭菌后为7.2±0.2,分装,灭菌。

6.改良马丁琼脂培养基

按改良马丁培养基的处方及制法,加入14.0g琼脂,调pH值使灭菌后为6.4±0.2,分装,灭菌。

2.1.2 培养基的适用性检查

无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

2.1.3 培养基的无菌性检查

每批培养基随机抽取不少于10支(瓶),5支(瓶)置30~35℃、另5支(瓶)置20~25℃培养14天,均应无菌生长

2.2 灵敏度检查

2.2.1 菌种

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC (B) 26003]

铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC (B) 10104]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941]

白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC (F) 98001]

黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC (F) 98003]

2.2.2 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35℃培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,20~25℃培养24~48小时,上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1ml含荫数小于100CFU(菌落形成单位)的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上,23~28℃培养5~7天,加入3~5ml无菌的含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液,将孢子洗脱然后,用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用无菌的含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100CFU的孢子悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存于2~8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

2.3 培养基接种

取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支,分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支,另1支不接种,作为空白对照,置30~35℃培养3天;取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种,作为空白对照,置20~25℃培养5天。逐日观察结果。

2.4 结果判定

空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定。稀释液、冲洗液及其制备方法

稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

(1)0.1%蛋白胨水溶液  称取蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,调pH值至7.1±0.2,分装,灭菌。

(2) pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液  称取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g,加水1000ml,微温溶解,滤清,分装,灭菌。

(3)0.9%氯化钠溶液  称取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装,灭菌(仅用于上述2种溶液不适用时使用)。

根据供试品的特性可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。如需要,可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

2.5 方法验证试验

当建立产品的无菌检查法时,应进行方法的验证,以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时,检查方法应重新验证。验证时,按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。

2.5.1 菌种及菌液制备

同培养基灵敏度检查。

2.5.2 薄膜过滤法

取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU的试验菌,过滤。将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,作为对照,细菌置30~35℃、真菌置20~25℃培养3~5天,逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。

2.5.3 直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管,分别接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管,取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管,分别接入小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定量的供试品量,另1管作为对照,细菌置30~35℃、真菌置20~25℃培养3~5天,逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。

2.5.4 结果判定

与对照管比较,如含供试品的各容器中的试验菌均生长良好,则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法,消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法验证试验。

验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

2.6 供试品的无菌检查

2.6.1 抽验数量

系指一次试验所用供试品最小包装容器的数量(支或瓶)。成品每亚批均应进行无菌检查。除另有规定外,原液半成品及成品按表1规定,上市产品监督检验按表2规定。

2.6.2 接种量

系指每个最小包装的最少取样量(ml或g)。除另有规定外,接种供试品量按表3规定。若采用直接接种法,按接种量要求等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中[两种培养基的接种支(瓶)数之比为2:1];若采用薄膜过滤法,应采用三联薄膜过滤器,其中两联加入硫乙醇酸盐流体培养基,另一联加入改良马丁培养基。只要供试品特性允许,应将所有容器内的内容物全部过滤。

2.6.3 阳性对照

以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查项下金黄色葡萄球菌菌液制备方法,加菌量小于100CFU。阳性对照也可在供试品无菌检查培养14天后,取其中1份硫乙醇酸盐流体培养基,加入小于100CFU阳性对照菌,作为阳性对照。阳性对照置30~35℃培养48~72小时应生长良好。

2.6.4 阴性对照

供试品无菌检查时,应取相应溶剂、稀释液和冲洗液同法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

无菌试验过程中,若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂,应证明其有效性,且对微生物生长无毒性。无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许,应采用薄膜过滤法。供试品的无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。

操作时,用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。如果供试品容器内有一定的真空度,可用适宜的无菌器材(如带有除菌过滤器的针头)向容器内导入无菌空气,再按无菌操作启开容器,取出内容物。

2.7 供试品处理及接种培养基

除另有规定外,按下列方法进行。

2.7.1 1.薄膜过滤法

采用封闭式薄膜过滤器,滤膜孔径应不大于0.45μm,直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试品溶液过滤前先将少量的冲洗液过滤,以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试品溶液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤

2.7.1.1 水溶液供试品

取规定量,每支(瓶)供试品装量为5ml及以下者,全部转移至含适宜稀释液100ml的无菌容器内,混匀,立即过滤;每支(瓶)供试品装量为5ml以上者直接过滤,或全部转移至含适量稀释液的无菌容器内,混匀,立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂,须用冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数一般不少于3次,所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后,2个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml,另一滤器中加入改良马丁培养基100ml。

2.7.1.2 水溶性固体供试品

取规定量,加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶,然后照水溶液供试品项下的方法操作。

2.7.1.3 非水溶性供试品

取规定量,混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液300ml的无菌容器内,充分混合,立即过滤。用含0.1%~1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数一般不少于3次。加入含或不含聚山梨酯80的培养基。其他照水溶液供试品项下的方法操作。

2.7.1.4 可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品

取规定量,混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯①中,剧烈振摇,使供试品充分溶解。如果需要可适当加热,但温度不得超过44℃,并趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品,于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试品溶液中加入不少于100ml的稀释液,充分振摇萃取,静置,取下层水相作为供试品溶液过滤。过滤后滤膜冲洗及加入培养基照非水溶性供试品项下的方法操作。

注:①无菌十四烷酸异丙酯的制备采用薄膜过滤法过滤除菌。选用孔径为0. 22Fcm的脂溶性滤膜(140℃干热灭菌2小时)过滤。

2.7.1.5 无菌气(喷)雾剂供试品

取规定量,将各容器置至少-20℃的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔,释放抛射剂后再无菌开启容器,并将供试品溶液转移至无菌容器中,然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

2.7.1.6 装有药物注射器供试品

取规定量,将注射器中的内容物(若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解)直接过滤,或混合至含适量稀释液的无菌容器内,混匀,立即过滤,然后按水溶性供试品项下方法操作。

同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。

2.7.2 2.直接接种法

直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。取规定量供试品,等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中(2种培养基的接种支数或瓶数之比为2:1)。除另有规定外,每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积,不得大于培养基体积的10%,同时,硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。

2.7.2.1 混悬液等非澄清水溶液供试品

取规定量,等量分别接种至各管培养基中。

2.7.2.2 固体供试品

取规定量,加入适宜的稀释剂溶解,或按标签说明复溶后混合,等量分别接种至各管培养基中。

2.7.2.3 非水溶性供试品

取规定量,混合,加入适量的聚山梨酯80或其他适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化;等量分别接种至各管培养基中,或等量分别直接接种至含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的各管培养基中。

2.7.2.4 培养及观察

将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份,一份置30~35℃培养14天;另一份与接种后的改良马丁培养基置20~25℃培养14天,培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中,培养基出现浑浊,培养14天后,不能从外观上判断有无菌生长,可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上,细菌培养2天,真菌培养3天,观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长;或取培养液(物)涂片,染色,镜检,判断是否有菌,必要时做菌种鉴定

2.7.2.5 结果判定

阳性对照管应生长良好,阴性对照管不得有菌生长。否则,试验无效。

若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确证无菌生长,判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长,判供试品不符合规定,除非能充分证明试验结果无效,即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少1个条件时方可判试验结果无效:

(1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

(2)回顾无菌试验过程,发现有可能引起微生物污染的因素。

(3)供试品管中生长的微生物经鉴定后,确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。

试验若经确认无效,应重试。重试时,重新取同量供试品,依法检查,若无菌生长,判供试品符合规定;若有菌生长,判供试品不符合规定。

表1  出厂制品不同规格及原液和半成品最少抽验数量

供试品

批产量(N);装置(V)

最少抽验数量

注射剂

N≤100

5个

100<N≤500

10个

N>500

20个

干血

液制品

V>5ml

每柜冻干N≤200

5个

每柜冻干N>200

10个

V≤5ml

N≤100

5个

100<N≤500

10个

N>500

20个

原液或

半成品

每个容器取样·取样量为每个容器制品总壁的0.1%或不少于10ml。每开瓶1次,应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批抽验量应不少于3ml

表2 上市制品监督抽验数量

品种及装量(V)

最少抽验数量

血液制品V<50ml

6个

V≥50ml

2个

其他生物制品

10个

表3 不同规格制品的最少接种量

规格

每支(瓶)供试品的最少接种量

液体制剂(ml)  V≤1

全量

1<V≤5

半量

5<V<20

2ml

20≤V<50

10ml

V≥50

半量

原液或半成品

半量

固体制剂 M<50mg

全量

50mg<M≤300mg

半量

300mg≤M<5g

150mg

M≥5g

半量

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3 附录Ⅻ B 支原体检查法

主细胞库工作细胞库病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时,应同时进行培养法和指示细胞法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体,必要时,亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

3.1 第一法  培养法

3.1.1 推荐培养基及其处方

(1)支原体肉汤培养基

胃消化液    500ml

氯化钠    2.5g

牛肉浸液(1:2)500ml

葡萄糖    5.0g

酵母浸粉    5.0g

酚红    0.02g

pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。

(2)精氨酸支原体肉汤培养基

猪胃消化液    500ml

葡萄糖    1.0g

牛肉浸液(1:2) 500ml

L-精氨酸    2.0g

酵母浸粉    5.0g

酚红    0.02g

氯化钠    2.5g

pH值7.1±0.2,于121℃灭菌15分钟。

(3)支原体半流体培养基  按(1)项处方配制,培养基中不加酚红,加入琼脂2.5~3.0g。

(4)支原体琼脂培养基  按(1)项处方配制,培养基中不加酚红,加入琼脂13.0~15.0g。

3.1.2 培养基灵敏度检查(变色单位试验法)

(1)菌种

肺炎支原体(ATCC 15531)、口腔支原体(ATCC23714),由国家药品检定机构分发。

(2)操作  将菌种接种于适宜的支原体培养基中,经36℃±1℃培养至培养基变色,盲传2代后,将培养物接种到待检培养基中,做10倍系列稀释,肺炎支原体稀释至10-7~10-9,接种在支原体肉汤培养基内;口腔支原体稀释至10-3~10-5,接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管,置36℃±1℃培养7~14天,观察培养基变色结果。

(3)结果判定  以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。

液体培养基的灵敏度:肺炎支原体(ATCC 15531)应达到10-8,口腔支原体(ATCC 23714)应达到10-4

3.1.3 检查法

(1)供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2~8℃;超过24小时应置-20℃以下贮存。

(2)检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基(或支原体琼脂培养基)。支原体半流体培养基(或琼脂培养基)在使用前应煮沸10~15分钟,冷却至56℃左右,然后加入灭能新生牛血清(培养基与血清体积比为8:2),并可酌情加入适量青霉素,充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外,使用前亦应同样补加上述成分。

取每支装量为10ml的支原体半流体培养基(已冷至36℃±1℃)和支原体肉汤培养基各4支,每支培养基接种供试品0.5~1.0ml,置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养,每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支,置36℃±1℃培养21天,每隔3天观察1次。

(3)结果判定  培养结束时,如接种供试品的培养基均无支原体生长,则供试品判为合格;如疑有支原体生长,可取加倍量供试品复试,如无支原体生长,供试品判为合格,如仍有支原体生长,则供试品判为不合格。

3.1.4 【附注】

质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。

3.2 第二法  指示细胞培养法(DNA染色法)

将供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞)中培养后,用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体,在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。

3.2.1 试剂

(1)二苯甲酰胺荧光染料浓缩液  称取二苯甲酰胺荧光染料5mg,加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank's平衡盐溶液中,室温下用磁力搅拌器搅拌30~40分钟,使完全溶解,-20℃避光保存。

(2)二苯甲酰胺荧光染料工作液  无酚红和碳酸氢钠的Hank's溶液100ml中加入二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml.混匀。

(3)固定液  醋酸甲醇(体积比1:3)混合溶液。

(4)封片液  量取0.1mol/L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml,混匀,调pH值至5.5。

3.2.2 培养基及指示细胞

(1) DMEM完全培养基

(2) DMEM无抗生素培养基。

(3)指示细胞(已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞)  取培养的Vero细胞经消化后,制成每1ml含105的细胞悬液,以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器,每孔再加无抗生素培养基3ml,于36℃±1℃、5%二氧化碳条件下培养过夜,备用。

3.2.3 供试品处理

(1)细胞培养物  将供试品经无抗生素培养液至少传1代,然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。

(2)毒种悬液  如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时,应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。

(3)其他供试品  检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。

3.2.4 测定法

于制备好的指示细胞培养板中加入供试品(细胞培养上清液)2ml(毒种或其他供试品至少1ml),于36℃±1℃、5%二氧化碳条件下培养3~5天。指示细胞培养物至少传代1次,末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3~5天后,吸出培养孔中的培养液,加入固定液5ml,放置5分钟,吸出固定液,再加5ml固定液固定10分钟,吸出固定液,使盖玻片在空气中干燥,加二苯甲酰胺荧光染料(或其他DNA染料)工作液5ml,加盖,室温放置30分钟,吸出染液,每孔用水5ml洗3次,吸出水,盖玻片于空气中干燥,取洁净载玻片加封片液1滴,分别将盏玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。

用无抗生素培养基2ml替代供试品,同法操作,作为阴性对照。

用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品,同法操作,作为阳性对照。

3.2.5 结果判定

(1)阴性对照  仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。

(2)阳性对照  荧光显微镜下除细胞外,可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。

当阴性及阳性对照结果均成立时,试验有效。

如供试品为阴性,则供试品判为合格;如供试品为阳性或可疑时,应进行重试;如供试品仍为阳性时,供试品判为不合格。

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4 附录Ⅻ C 病毒外源因子检查法

病毒类制品在毒种选育和生产过程中,经常使用动物或细胞基质培养,因此,有可能造成外源因子(特别是外源病毒因子)的污染。为了保证制品质量,需要对毒种和细胞进行外源因子的检测

4.1 病毒种子批外源因子检查

对病毒主种子批工作种子批,应抽取足够检测试验需要量的供试品进行病毒外源因子检测。在试验前应用非人源和非猴源(特殊情况除外)的特异性抗体中和本病毒。制备抗血清(或单克隆抗体)所用的免疫原应采用与生产疫苗(或制品)不同种而且无外源因子污染的细胞(或动物)制备。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过,则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚,应来自SPF鸡群。

4.1.1 1.动物试验法

(1)小鼠试验法  取15~20g小鼠至少10只,用经抗血清中和后的病毒悬液,每只脑内接种0.03ml,同时腹腔接种0.5ml,至少观察21天。在观察期内至少有80%最初接种的小鼠存活,试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染,为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠,直接肉眼观察其病理改变,并将有病变的相应组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只15~20g小鼠,观察21天,如果没有小鼠出现病毒感染,则符合要求:

(2)乳鼠试验法  取出生后24小时内的乳鼠至少10只,用经抗血清中和后的病毒悬液,脑内接种0.01ml,同时腹腔接种至少0.1ml。每天观察,至少14天。在观察期内至少有80%最初接种的乳鼠存活,试验才有效。如果没有乳鼠出现病毒感染,为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠,直接肉眼观察其病理改变,并取有病变的相应组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只出生后24小时内的乳鼠,每天观察至接种后第14天,如果没有乳鼠出现病毒感染,则符合要求。

4.1.2 2.细胞培养法

(1)非血吸附病毒检查  将经抗血清中和后的病毒悬液,分别接种于人源、猴源和生产用的同种细胞。用人二倍体细胞生产的,还应接种另外一株人二倍体细胞。每种细胞至少接种6瓶,每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。于36℃±1℃培养,观察14天,必要时可更换细胞培养液,未见细胞病变为阴性;符合要求。

(2)血吸附病毒检查  上述接种病毒的各种细胞于第6~8天和第14天,每种细胞各取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2%~0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于细胞表面,于2~8℃放置30分钟,然后于20~25℃放置30分钟,分别进行镜检,观察红细胞吸附情况,结果应均为阴性。

4.1.3 3.鸡胚检查法

在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选用9~11日龄和5~7日龄两组SPF鸡胚,每组至少5只,分别于尿囊腔和卵黄囊接种经抗血清中和后的病毒悬液,每胚0.5ml。孵育7天后,取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞混合悬液做血细胞凝集试验,应为阴性。被接种的鸡胚至少80%存活7天,试验有效。

4.2 生产用细胞外源因子检查

4.2.1 1.非血吸附病毒检查

(1)细胞直接观察  每批生产用细胞应留取5%(或不少于500ml)细胞悬液不接种病毒,作为对照细胞加入

与疫苗生产相同的细胞维持液,置与疫苗生产相同的条件下培养,观察14天,在显微镜下观察是否有细胞病变出现,无细胞病变出现者为阴性,符合要求。在观察期末至少有80%的对照细胞培养物存活,试验才有效。

(2)细胞培养试验  上述试验观察期末,收取上清液混合后,取适量接种于猴源和人源的细胞培养物,如果疫苗病毒在非猴源或非人源其他细胞系上生产,还应接种于同种不同批细胞。接种量应不少于总量的25%。每种细胞至少检查5ml上清混合液,置与生产相同的培养条件下培养。无细胞病变者为阴性,符合要求。

4.2.2 2.血吸附病毒检查

对上述“细胞直接观察”及“细胞培养试验”的细胞培养物,在观察期末取至少25%的细胞培养瓶进行血吸附病毒检查(方法同病毒种子批外源因子检查的血吸附病毒检查)。

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5 附录Ⅻ D 热原检查法

本法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

5.1 供试用家兔

供试用的家兔至少应为普通级动物,体重1.7~3.0kg,雌兔应无孕。预测体温前7天即应用同一饲料饲养,在此期间内,体重应不减轻,精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未曾用于热原检查的家兔,应在检查供试品前3~7天内预测体温,进行挑选。挑选的条件与检查供试品相同,仅不注射药液,每隔30分钟测量体温1次,共测8次,8次体温均在38.0~39.6℃的范围内,且最高与最低体温相差不超过0.4℃的家兔,方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔,若供试品判定为符合规定,至少应休息48小时后可重复使用;对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用1次。若供试品判定为不符合规定,则组内全部家兔不得再使用。

5.2 试验前准备

热原检查前1~2天,供试验用家兔应尽可能处于同一温度的环境中,实验室和饲养室的温度相差不得大于3℃,实验室的温度应在17~25℃,热原检查全过程中,应注意室温变化不得大于3℃;并应保持安静,避免强光照射,避免噪声干扰和引起动物骚动。家兔在检查前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装置中,直至检查完毕。家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同,深度一般约6cm,时间不得少于1.5分钟。每隔30分钟测量体温1次,一般测量2次,2次体温之差不得超过0.2℃,以此2次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔,正常体温应在38.0~39.6℃的范围内,同组各兔间正常体温之差不得超过l℃。

检查用的注射器、针头及一切与供试品接触的器皿,应置干烤箱中用250℃加热30分钟,也可用其他适宜方法除热原。

5.3 检查法

供试品或稀释供试品的无热原稀释液,在注射前应预热至38℃。供试品的注射剂量按各品种的规定,但家兔每1kg体重注射体积不得少于0.5ml,不得大于10ml。

取适用的家兔3只,测定其正常体温后15分钟内,自家兔耳静脉缓缓注入规定剂量并预热至38℃的供试品溶液,然后每隔30分钟按前法测量其体温1次,共测6次,以6次体温中最高的1次减去正常体温,即为该兔体温升高的温度。如3只家兔中,有1只家兔体温升高0.6℃或0.6℃以上;或3只家兔体温升高均低于0.6℃,但体温升高的总和达1.4℃或1.4℃以上,应另取5只家兔复试,检查方法同上。

5.4 结果判定

在初试3只家兔中,体温升高均低于0.6℃,并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔仅有1只,并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下,均认为供试品的热原检查符合规定。在初试的3只家兔中,体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只;或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5℃,均认为供试品的热原检查不符合规定。

当家兔升温为负值时,均以0℃计。

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6 附录Ⅻ E 细菌内毒素检查法

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法结果为准。

本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。

细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示,1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。

细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成,用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

细菌内毒素检查用水系指内毒紊含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005EU/ml(用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水

试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法(250℃、30分钟以上)去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

6.1 供试品溶液的制备

某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0~8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

6.2 内毒素限值的确定

药品、生物制品的细菌内毒素限值(L) 一般按以下公式确定:

L=K/M

式中  L为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU/ml、

EU/mg或EU/U(活性单位)表示;

K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(kg·h)表示,注射剂K=5EU/(kg·h),放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg·h);

M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,以ml(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示,人均体重按60kg计算,人体面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时,按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)。

按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用药实际情况做必要调整,但需说明理由。

6.3 确定最大有效稀释倍数(MVD)

最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(1→MVD),在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:

MVD=cL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值;

c为供试品溶液的浓度,当L以EU/ml表示时,则c等于1.0ml/ml,当L以EU/mg或EU/U表示时,c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药,则MVD取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L;

λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

6.4 方法1  凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

6.4.1 鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒索的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支,其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做4管;另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37℃±1℃的恒温器中,保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。

λc=antilg(∑X/4)

式中  X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

6.4.2 干扰试验

按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按黉试剂灵敏度复核试验项下操作。

表1  凝胶法干扰试验溶液的制备

编号

内毒素浓度/被加入内毒素的溶液

稀释用液

稀释

倍数

所含内毒

素的浓度

平行

管数

A

无/供试品溶液

-

-

-

2

B

2λ/供试品溶液

供试品溶液

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

4

4

4

4

C

2λ/检查用水

检查用水

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

4

4

4

4

D

无/检查用水

-

-

-

2

注:A为供试品溶液;B为干扰试验系列;C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D为阴性对照。

只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时,试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(ES和Et):

ES=antilg(∑XS/4)

Et=antilg(∑XS/4)

式中  XS、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。

当ES在0.5λ~2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES~2ES(包括0.5ES和2ES)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新药的内毒素检查试验前,或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时,须进行干扰试验。

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

6.4.3 检查法

6.4.3.1 (1)凝胶限度试验

按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表2 凝胶限度试验溶液的制备

编号

内毒索浓度/被加入内毒素的溶液

平行管数

A

无/供试品溶液

2

B

2λ/供试品溶液

2

c

2λ/检查用水

2

D

无/检查用水

2

注:A为供试品溶液;B为供试品阳性对照;C为阳性对照;D为阴性对照。

结果判断  保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,阳性对照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。

若溶液A的两个平行管均为阴性,判定供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性,判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性,另一管为阴性,需进行复试。复试时,溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,判定供试品符合规定;否则判定供试品不符合规定。

6.4.3.2 (2)凝胶半定量试验

本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

结果判断  若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ~2λ之间,试验有效。

系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ,为每个系列的反应终点浓度,所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度(按公式cE=antilg(∑X/2)]。如果检验时采用的是供试品的稀释液,则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。

如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性,应记为内毒素浓度小于λ(如果检验的是稀释过的供试品,则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数)。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性,应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

若内毒素浓度小于规定的限值,判定供试品符合规定。若内毒素浓度大手或等于规定的限值,判定供试品不符合规定。

表3 凝胶半定量试验溶液的制备

编号

内毒素浓度/被

加入内毒素的溶液

稀释用液

稀释

倍数

所含内毒

素的浓度

平行

管数

A

无/供试品溶液

检查用水

1

2

4

8

-

-

-

-

2

2

2

2

B

2λ/供试品溶液

、1

2A

2

C

2λ/检查用水

检查用水

1

2

4

8

0.5λ

0.25λ

2

2

2

2

D

无/检查用水

-

-

-

2

注:A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍,最后的稀释倍数不得超过MVD。

B为2λ浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照)。

C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。

D为阴性对照。

6.5 方法2  光度测定法

光度测定法分为浊度法和显色基质法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间,或检测色度增长速度的方法。

光度测定试验需在特定的仪器中进行,温度一般为37℃±1℃。

供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,参照所用仪器和试剂的有关说明进行。为保证浊度和显色试验的有效性,应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

6.5.1 标准曲线的可靠性试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。

用标准内毒素制成溶液,制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不得大于10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法,每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间,将全部数据进行线性回归分析

根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980,试验方为有效。否则须重新试验。

6.5.2 干扰试验

选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm),作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。

R=(cs-ct)/λm×100% [1]

当内毒素的回收率在50%~200%之间,则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

表4  光度测定法干扰试验溶液的制备

编号

内毒素浓度

被加入内毒素的溶液

平行管数

A

供试品溶液

至少2

B

标准曲线的中点(或附近点)的浓度(设为λm)

供试品溶液

至少2

C

至少3个浓度(最低一点设定为λm)

检查用水

每一浓度至少2

D

检查用水

至少2

注:A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。

B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的,且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。

C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的,用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

D为阴性对照。

当内毒素的回收率在50%~200%之间,则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

当内毒素的回收率不在指定的范围内,须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素,并重复干扰试验来验证处理的有效性。

当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

6.5.3 检查法

按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。

使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。

试验必须符合以下三个条件方为有效:

(1)系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求;

(2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后,计算出的内毒素的回收率要在50%~200%的范围内;

(3)溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

6.5.4 结果判断

若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后,小于规定的内毒素限值,判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值,判定供试品不符合规定。

注:本检查法中,“管”的意思包括其他任何反应容器,如微孔板中的孔。

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7 附录Ⅻ F 异常毒性检查法

本法系生物制品的非特异性毒性的通用安全试验,检查制品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。

7.1 检查法

除另有规定外,异常毒性试验应包括小鼠试验和豚鼠试验。

将供试品温度平衡至室温,按照规定的给药途径缓慢注入动物体内。试验中应设同批动物空白对照,观察期内,动物全部健存,且无异常反应,到期时每只动物体重增加,则,判定试验成立。

7.1.1 (1)小鼠试验法

除另有规定外,每批供试品用5只小鼠,注射前每只小鼠称体重,应为18~22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml,观察7天。观察期内,小鼠应全部健存,且无异常反应,到期时每只小鼠体重应增加,供试品判为合格。如不符合上述要求,可用10只小鼠复试1次,判定标准同前。

7.1.2 (2)豚鼠试验法

除另有规定外,每批供试品用2只豚鼠,注射前每只豚鼠称体重,应为250~350g。每只豚鼠腹腔注射供试品5.0ml,观察7天。观察期内,豚鼠应全部健存,且无异常反应,到期时每只豚鼠体重应增加,供试品判为合格。如不符合上述要求,可用4只豚鼠复试1次,判定标准同前。

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8 附录Ⅻ G 微生物限度检查法

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外,本检查法中细菌及控制菌培养温度为30~35℃;霉菌、酵母菌培养温度为23~28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告。

8.1 检验量

检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。

检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。

8.2 试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。

除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。

8.2.1 1.液体供试品

取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1: 10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

8.2.2 2.固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,一作为1:10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

8.2.3 3.需用特殊方法制备供试液的供试品

8.2.3.1 (1)非水溶性供试品

方法1  取供试品5g(或5ml),加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1: 20的供试液。

方法2  取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见2010年版药典三部附录Ⅻ A 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5~10分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为1:10的供试液。

8.2.3.2 (2)膜剂供试品

取供试品100cm2,剪碎,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml(必要时可增加稀释液),浸泡,振摇,作为1: 10的供试液。

8.2.3.3 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml,置45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1: 10的供试液。

8.2.3.4 (4)气雾剂喷雾剂供试品

取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1小时,取出,迅速消毒供试品开启部位,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(若含非水溶性成分,加适量的无菌聚山梨酯80)中,混匀,取相当于10g或10ml的供试品,再稀释成1: 10的供试液。

8.2.3.5 (5)贴剂供试品

取规定量供试品,去掉贴剂的保护层,放置在无菌玻璃或塑料片上,粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布)覆盖贴剂的粘贴面,以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀释剂中,用力振荡至少30分钟,制成供试液。贴剂也可采用其他适宜的方法制备成供试液。

8.2.3.6 (6)具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时,采用下列方法进行处理,以消除供试液的抑菌活性,再依法检查。常用的方法如下。

①培养基稀释法  取规定量的供试液,至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少,至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时,取同稀释级的供试液2ml,每1ml供试液可等量分注多个平皿,倾注琼脂培养基,混匀,凝固,培养,计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数,计算每1ml供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数;控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量。

离心沉淀法  取一定量的供试液,500转/分钟离心3分钟,取全部上清液混合。用于细菌检查。

③薄膜过滤法  见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。

④中和法  凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品,可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

8.3 细菌、霉菌及酵母菌计数

8.3.1 计数培养基的适用性检查

细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

菌种  试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC (B) 44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC (B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC (F) 98001]

黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC (F) 98003]

菌液制备  接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,培养5~7天,加入3~5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。

适用性检查  取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100CFU,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固.置30~35℃培养48小时,计数;取白色念珠菌、黑曲霉各50~100CFU,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23~28℃培养72小时,计数;取白色念珠菌50~100CFU,注入无菌平皿中,立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,平行制备2个平皿,混匀。凝固,置23~28℃培养72小时,计数。同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

结果判定  若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定。

8.3.2 计数方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。

验证时,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

菌种及菌液制备  同计数培养基的适用性检查。

验证方法  验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

(1)试验组  平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50~100CFU试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50~100CFU试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数。

(2)菌液组  测定所加的试验菌数。

(3)供试品对照组  取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

(4)稀释剂对照组  若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100CFU,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

结果判断  在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌数回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌数回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法(常见干扰物的中和剂或灭活方法见表1)等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。

表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法

干扰物

可选用的中和剂或灭活方法

戊二醛

亚硫酸氢钠

酚类、乙醇、吸附物

稀释法

醛类

稀释法、甘氨酸、硫代硫酸

季铵类化合物(QACs)、

卵磷脂、聚山梨酯

羟基苯甲酸

汞类制剂

亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐

双胍类化合物

卵磷脂

碘酒、洗必泰

聚山梨酯

卤化

硫代硫酸盐

乙二胺四乙酸( EDTA)

镁或钙离子

磺胺

对氨基苯甲酸

β-内酰胺类抗生素

β-内酰胺酶

若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性,那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的,同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是,供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用,而对其他菌株没有抑制作用。因此,根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则,在不影响检验结果判断的前提下,应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求,应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。

计数方法验证时,采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。

验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

8.3.3 供试品检查

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母蔺菌数的测定。

按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成1:10、1:102、1:103等稀释级的供试液。

8.3.3.1 1.平皿法

根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验  取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板,均不得有菌生长。

培养和计数  除另有规定外,细菌培养3天,霉菌、酵母菌培养5天,逐日观察菌落生长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数;玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数;酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。

蜂蜜王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数。

菌数报告规则  细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300CFU、霉菌宜选取平均菌落数小于100CFU的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。

如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

8.3.3.2 2.薄膜过滤法

采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45μm,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

阴性对照试验  取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。培养和计数  培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100CFU。

菌数报告规则  以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数;若滤膜上无菌落生长,以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品),或<1乘以稀释倍数的值报告菌数。

8.3.4 控制菌检查

8.3.4.1 控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

菌种  对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC (B) 44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC (B)26003]

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC (B) 50094]

铜绿假单胞菌(Pseudtrmonas aerugznosa)  [CMCC (B)10104]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC (B)64941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC (F) 98001]

菌液制备  接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,培养18~24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24~48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100CFU的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在2~8℃可在24小时内使用。

适用性检查  控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。各培养基的检测项目及所用菌株见表2。

表2 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查

控制菌检查

培养基

特性

试验菌株

大肠埃希菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

大肠埃希菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

大肠菌群

乳糖胆盐发酵培养基

促生长能力

大肠埃希菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

乳糖发酵培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

沙门菌

营养肉汤培养基

促生长能力

乙型副伤寒沙门菌

硫磺酸钠亮绿培养基

促生长能力

乙型副伤寒沙门菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺菌属琼脂培养基

促生长能力+指示能力

乙型副伤寒沙门菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

促生长能力+指示能力

乙型副伤寒沙门菌

三糖铁琼脂培养基

指示能力

乙型副伤寒沙门菌

铜绿假单胞菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

大肠埃希菌

绿脓菌素测定用培养基

促生长能力+指示能力

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

亚碲酸盐肉汤培养基

促生长能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基

促生长能力+指示能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

梭菌

梭菌增菌培养基

促生长能力

生孢梭菌

哥伦比亚琼脂培养基

促生长能力

生孢梭菌

白色念珠菌

沙氏葡萄糖液体培养基

促生长能力

白色念珠菌

沙氏葡萄糖琼脂培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

念珠菌显色培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

抑制能力

大肠埃希菌

1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

液体培养基促生长能力检查  分别接种不大于100CFU的试验菌(表2)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生长能力检查  取试验菌各0.1ml(含菌数50~100CFU)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

培养基抑制能力检查  接种不少于100CFU的试验菌(表2)于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养,试验菌应不得生长。

固体培养基指示能力检查  取试验菌各0.1ml(含菌数不大于100CFU)(表2)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上,在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

液体培养基指示能力检查  分别接种不大于100CFU的试验菌(表2)于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。

8.3.4.2 控制菌检查方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合予该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查方法应重新验证。

验证时,依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。

菌种及菌液制备  同控制菌检查用培养基的适用性检查。

验证方法  取规定量供试液及10~100CFU试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注入增菌培养基或取出滤膜接人增菌培养基中。

结果判断  若上述试验检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若未检出试验菌,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

8.3.4.3 供试品检查

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。

阳性对照试验  阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加菌量为10~100CFU。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验  取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查,作为阴性对照.阴性对照应无菌生长。

(1)大肠埃希菌(Escherichia coli)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml,接种至含5ml MUG培养基的试管内,培养,于5小时、24小时在366nm紫外光下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光,为MUG阳性;不呈现荧光,为MUG阴性。观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本色,为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性、靛基质阴性,判供试品未检出大肠埃希菌;如MUG阳性、靛基质阴性,或MUG阴性、靛基质阳性,则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符,判供试品来检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验,确认是否为大肠埃希菌。

表3  大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃红色或微红色,菌落中心星深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润

(2)大肠菌群(Coriform)  取含适量(不少于10ml)的乳糖胆盐发酵培养基管3支,分别加入1: 10的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml)、1: 100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、1: 1000的供试液1ml(含供试品0.001g或0.001ml),另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18~24小时。

乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气,判该管未检出大肠菌群;若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

若平板上无菌落生长,或生长的菌落与表4所列的菌落形态特征不符或为非革兰氏阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征柑符或疑似,且为革兰氏阴性无芽孢杆菌,应进行确证试验

表4 大肠菌群菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

紫黑色、紫红色、红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润

麦康凯琼脂

鲜桃红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润

确证试验  从上述分离平板上挑选4~5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培养24~48小时。若产酸产气,判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。

根据大肠菌群的检出管数,按表5报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表5 可能的大肠菌群数

各供试品量的检出结果

可能的大肠菌群数N

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

0.001g或0.001ml

(个/g或ml)

+

+

+

-

+

+

-

-

+

-

-

-

>103

102<N<103

10<N<102

<10

注:+代表检出大肠菌群;-代表未检出大肠菌群。

(3)沙门菌(Salmonella)  取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量(不少于200ml)的营养肉汤培养基中,用匀浆仪或其他适宜方法混匀,培养18~24小时。

取上述培养物1ml,接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18~24小时后,分别划线接种子胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上,培养18~24小时(必要时延长至40~48小时)。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表6所列的特征,判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落与表6所列的菌落形态特征相符或疑似,用接种针挑选2~3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养18~24小时,如斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色、底层无黑色,判供试品未检出沙门菌。否则,应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验,确认是否为沙门菌。

表6 沙门菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

胆盐硫乳琼脂

无色至浅橙色,半透明,菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色

沙门、志贺菌属琼脂

无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心有时带黑褐色

曙红亚甲蓝琼脂

无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的圆形菌落

麦康觊琼脂

无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心有时为暗色

(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时。取上述培养物,划线接种子溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润,灰白色,周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰氏染色、镜检及氧化酶试验。

氧化酶试验  取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取斜面培养物涂子滤纸片上,滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则,应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素(Pyocyanin)试验  取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上,培养24小时,加三氯甲烷3~5ml至培养管中,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将三氯甲烷相移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,观察。若盐酸溶液呈粉红色,为绿脓菌素试验阳性,否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照,阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性,判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性,应继续进行适宜的鉴定试验,确认是否为铜绿假单胞菌。

(5)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。取上述培养物,划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,培养24~72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表7所列特征,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

表7  金黄色葡萄球菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

甘露醇氯化钠琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有黄色环,菌落直径0.7~1mm

卵黄氯化钠琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,外围有卵磷脂分解的乳浊圈,菌落直径1~2mm

若平板上生长的菌落与表7所列的菌落特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰氏染色,并接种于营养肉汤培养基中,培养18~24小时,做血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验  取灭菌小试管3支,各加入血浆和无菌水混合液(1:1)0.5ml,再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5 ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml.即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养,3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如,阳性对照管血浆应凝固,若试验管血浆凝固为血浆凝固酶试验阳性,否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时,应另制备血浆,重新试验。

若上述疑似菌为非革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

(6)梭菌(Clostridium)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)2份,其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48小时。取上述每一培养物0.2ml.分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比皿琼脂培养基平板上,置厌氧条件下培养48~72小时。若平板上无菌落生长,判供试品未检出梭菌;若平板上有菌落生长,应挑选2~3个菌落分别进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。

过氧化氧酶试验  取上述平板上的菌落,置洁净玻片上,滴加3%过氧化氢试液,若菌落表面有气泡产生,为过氧化氢酶试验阳性,否则为阴性。

若上述可疑菌落为革兰氏阳性梭菌,有或无卵圆形或球形的芽孢,过氧化氢酶试验阴性,判供试品检出梭菌,否则判供试品未检出梭菌。

(7) 白色念珠菌(Candida albicans)  取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的沙氏葡萄糖液体培养基中,培养48~72小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色,偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大,颜色变深、质地变硬或有皱褶。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长.判供试品未检出白色念珠菌。

若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色,挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上,培养24~48小时。取培养物进行染色、镜检及芽管试验。芽管试验  挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物,接种于加有一滴血清的载玻片上,盖上盖玻片,置湿润的平皿内,于35~37℃培养1~3小时,置显微镜下观察孢子上有否长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰氏阳性菌,显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管,判供试品未检出白色念珠菌。

8.4 结果判断

供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。

供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定,应从同一批样品中随机抽样,独立复试两次,以3次结果的平均值报告菌数。

若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定,判供试品符合规定;若其中任何一项不符合该品种项下的规定,判供试品不符合规定。

8.5 稀释液

稀释液配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1.pH7,0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

照无菌检查法(2010年版药典三部附录Ⅻ A)制备。

2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液

按缓冲液(2010年版药典二部附录XV D)配制后,过滤,分装,灭菌。

如需要,可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

3. 0.9%无菌氯化钠溶液

取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装,灭菌。

8.6 培养基及其制备方法

培养基可按以下处方制备,也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后,应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基

照无菌检查法(2010年版药典三部附录Ⅻ A)制备。

2.玫瑰红钠琼脂培养基

胨 5.0g

玫瑰红钠 0.0133g

葡萄糖 10.0g

琼脂 14.0g

磷酸二氢钾 1.0g

水 1000m1

硫酸镁    1.5g

除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过,加入葡萄糖、玫瑰红钠,分装,灭菌。

3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)

胨10.0g

琼脂14.0g

酵母浸出粉 5.0g

水1000ml

葡萄糖 20.0g

除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过,加人葡萄糖,分装,灭菌。

4.胆盐乳糖培养基(BL)

胨 20.0g

磷酸二氢钾 1.3g

乳糖 5.0g

氯化钠 5.0g

牛胆盐 2.0g(或去氧胆酸钠)  (0.5g)

磷酸氢二钾 4.0g

水1000ml

除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠,分装,灭菌。

5.乳糖胆盐发酵培养基

胨 20.0g

0.04%溴甲酚紫指示液25ml

乳糖 10.0g

水 1000ml

牛胆盐 5.0g

除0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,加入0.04%溴甲酚紫指示液,根据要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的观察。

6.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)

营养琼脂培养基 100ml

曙红钠指示液 2ml

20%乳糖溶液 5ml

亚甲蓝指示液1.3~1.6ml

取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60C,按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液,摇匀,倾注平皿。

7.麦康凯琼脂培养基(MacC)

胨 20.0g

1%中性红指示液 3ml

乳糖 10.0g

琼脂 14.0g

牛胆盐 5.0g

水 1000ml

氯化钠 5.0g

除乳糖、1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,冷至约60℃,倾注平皿。

8. 4-甲基伞形酮葡糖苷酸 (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide,MUG)培养基

胨 10.0g

磷酸二氢钾(无水) 0.9g

硫酸锰 0.5mg

磷酸氢二钠(无水)6.2g

硫酸锌0. 5mg

亚硫酸钠40mg

硫酸镁0.1

去氧胆酸钠1.0g

氯化钠5.0g

MUG 75mg

氯化钙50mg

水1000ml

除MUG外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入MUG,溶解,每管分装5ml,灭菌。

9.三糖铁琼脂培养基(TSI)

胨 20.0g

硫酸亚铁0.2g

牛肉浸出粉5.0g

硫代硫酸钠 0.2g

乳糖10.0g

0.2%酚磺酞指示液12.5ml

蔗糖10.0g

琼脂12.0g

葡萄糖1.0g

水1000ml

氯化钠5.0g

除三种糖、0.2%酚磺酞指示液、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,制成高底层(2~3cm)短斜面。

10.四硫磺酸钠亮绿培养基 (TTB)

胨 5.0g

硫代硫酸钠 30.0g

牛胆盐 1.0g

水 1000ml碳酸钙 10.0g

取上述成分,混合,微温溶解,灭菌。

临用前,取上述培养基,每10ml加入碘试液0.2ml和亮绿试液0.1ml,混匀。

11. 沙门、志贺菌属琼脂培养基(SS)

胨 5.0g

硫代硫酸钠 8.5g

牛肉浸出粉 5.0g

中性红指示液 2.5ml

乳糖 10.0g

亮绿试液 0.33ml

牛胆盐 8.5g

琼脂 16.0g

枸橼酸钠 8.5g

水1000ml

枸橼酸铁铵1.0g

除乳糖、中性红指示液、琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,滤过,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

12.胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)

胨 20.0g

枸橼酸钠 1.0g

牛肉浸出粉 3.0g

枸橼酸铁铵 1.0g

乳糖 10.0g

中性红指示液 3ml

蔗糖 10.0g

琼脂 16.0g

去氧胆酸钠 1.0g

水 1000ml

硫代硫酸钠 2.3g

除糖、指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.1,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余成分,摇匀,冷至60℃,倾注平皿。

13. 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

胨 10.0g

溴化十六烷基三甲铵0.3g

牛肉浸出粉 3.0g

琼脂 14.0g

氯化钠 5.0g

水 1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1,加入琼脂,加热溶化后,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

14. 亚碲酸盐肉汤培养基

临用前,取灭菌的营养肉汤培养基,每100ml中加入新配制的1%亚碲酸钠(钾)试液0.2ml,混匀,即得。

15.卵黄氯化钠琼脂培养基

胨 6.0g

10%氯化钠卵黄液100ml

牛肉浸出粉 1.8g

琼脂 14.0g

氯化钠 30.0g

水 650ml

除10%氯化钠卵黄液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1,灭菌,待冷至约60℃,以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液,充分振摇,倾注平皿。

10%氯化钠卵黄液的制备  取新鲜鸡蛋1个,以无菌操作取出卵黄,放入10%无菌氯化钠溶液100ml中,充分振摇,即得。

16.甘露醇氯化钠琼脂培养基

胨 10.0g

酚磺酞指示液 2.5ml

牛肉浸出粉 1.0g

琼脂 14.0g

甘露醇 10.0g

水 1000ml

氯化钠 75.0g

除甘露醇、酚磺酞指示液及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,加入琼脂,加热溶化后,滤过,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。

17.乳糖发酵培养基

胨 20.0g

乳糖 10.0g

0.04%溴甲酚紫指示液 25ml

水 1000ml

除0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入指示液,分装于含倒管的小试管中,每管3ml。灭菌。

18.绿脓菌素(Pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂培养基)

胨 20.0g

甘油 10ml

氯化镁(无水) 1.4g

琼脂 14.0g

硫酸钾(无水) 10.0g

水 1000ml

取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1,加入甘油及琼脂,加热溶化,混匀,分装于试管,灭菌,置成斜面。

19.梭菌增菌培养基

牛肉浸出粉 10.0g

盐酸半胱氨酸 0.5g

胨 10.0g

氯化钠 5.0g

酵母浸出粉 3.0g

醋酸钠 3.0g

可溶性淀粉 1.0g

琼脂 0.5g

葡萄糖 5.0g

水 1000ml

取上述成分,混合,加热煮沸使溶解,调节pH值使灭菌后为6.8±0.2,加热溶化,滤过,分装,灭菌。

20.哥伦比亚琼脂培养基

酪蛋白胰酶消化物 10.0g

胃酶消化物 5.0g

心胰酶消化物 3.0g

酵母浸出粉 5.0g

玉米淀粉 1.0g

氯化钠 5.0g

琼脂 15.0g

水 1000ml

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.2,加入琼脂,加热溶化,滤过,分装,灭菌,冷至45~50℃,加入相当于20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素,混匀,倾注平皿。

21.沙氏葡萄糖液体培养基

胨 10g

葡萄糖 40g

水 1000ml

除葡萄糖外,取上述成分,混合,微温溶解,滤过。加入葡萄糖,溶解,分装,灭菌。

22.沙氏葡萄糖琼脂培养基

胨 10g

水 1000ml

葡萄糖 40g

琼脂 14g

除琼脂和葡萄糖外,混合,微温溶解,滤过。加入琼脂和葡萄糖,溶解,分装,灭菌。

23.(科玛嘉)念珠菌显色培养基①

胨 10.2g

琼脂 15g

氢罂素 0.5g

灭菌水 1000ml

色素 22.0g

除琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值至6.3±0.2。滤过,加入琼脂,加热煮沸,不断搅拌至琼脂完全溶解,倾注平皿。

24. 1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基

黄色玉米粉 40g

琼脂 10~15g

聚山梨酯80 10ml

水 1000ml

取玉米粉、聚山梨酯80及蒸馏水500ml,混合,65℃加热30分钟,混匀,用纱布滤过,补足原水量。取琼脂,水500ml,混合,加热溶解。将以上两种溶液混合,摇匀,分装,灭菌。

8.7 微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验,原料及辅料的检验,新药标准制订,进口药品标准复核,考察药品质量及仲裁等,除另有规定外,其微生物限度均以本标准为依据。

1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂  应符合无菌检查法规定。

2.口服给药制剂

细菌数  每1g不得过1000CFU。每1ml不得过100CFU。

霉菌和酵母菌数  每1g或1ml不得过100CFU。

①本检查法中白色念珠菌检查所描述该菌在念珠菌显色培养基上的菌落特征,是指该菌在法国科玛嘉公司提供的科玛嘉念珠菌显色培养基上生长的菌落特征。给出这一信息是为了方便本方法的使用者,并不表示对该公司产品的认可。若其他等效产品具有相同的效果,那么也可使用其他等效的产品。

大肠埃希菌  每1g或1ml不得检出。

3.局部给药制剂

3.1  用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。

3.2   耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂

细菌数  每1g、1ml或10cm2不得过100CFU。

霉菌和酵母菌数  每1g、1ml或10cm2不得过10CFU。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌  每1g、1ml或10cm2不得检出。

大肠埃希菌  鼻及呼吸道给药的制剂,每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.3  阴道尿道给药制剂

细菌数  每1g、1ml或10cm2不得过100CFU。

霉菌数和酵母菌数  每1g、1ml或10cm2应小于10CFU。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌  每1g、1ml或10cm2不得检出。

3.4  直肠给药制剂

细菌数  每1g不得过1000CFU。每1ml不得过100CFU。

霉菌和酵母菌数  每1g或1ml不得过100CFU。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌  每1g或1ml不得检出。

3.5  其他局部给药制剂

细菌数  每1g、1ml或10cm2不得过100CFU。

霉菌和酵母菌数  每1g、1ml或10cm2不得过100CFU。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌  每1g、1ml或10cm2不得检出。

4.含动物组织(包括提取物)的口服给药制剂  每10g或10ml还不得检出沙门菌。

5.有兼用途径的制剂  应符合各给药途径的标准。

6.霉变、长螨者  以不合格论。

7.原料及辅料  参照相应制剂的微生物限度标准执行。

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9 附录Ⅻ H 鼠源性病毒检查法

鼠源性单克隆抗体制品具有潜在病毒污染,如出血热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、Ⅲ型呼肠孤病毒仙台病毒、脱脚病病毒、小鼠腺病毒、小鼠肺炎病毒、逆转录病毒等。其中前4种病毒属Ⅰ组,为能够感染人与灵长类动物的病毒;后4种属Ⅱ组,为目前尚无迹象表明感染人的病毒,但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制,对人类具有潜在危险性,这些病毒应作为重点进行检测。

本法用于杂交瘤细胞株及鼠源性单克隆抗体制品的鼠源性病毒检测。通过细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等检测活病毒抗原及病毒抗体。

9.1 试剂

(1) 0.01mol/L pH7.4 PBS  称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.9g、磷酸二氢钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g,加水溶解并稀释至1000ml。

(2) pH9.6包被缓冲液  称取碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g、叠氮钠0.20g,加水溶解并稀释至1000ml。

(3)0.01mol/L pH7.4 PBS洗液  称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.9g、磷酸二氢钠0.295g、氯化钠8.5g、聚山梨酯80 5ml,加水溶解并稀释至1000ml。

(4)底物缓冲液  称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)  12.9g、枸橼酸3.26g,加水溶解并稀释至700ml。

(5)底物溶液  称取邻苯二胺4mg,溶于底物缓冲液10ml中,再加入30%过氧化氢4μl。

(6)终止液  1mol/L硫酸溶液。

9.2 供试品的制备

供试品包括杂交瘤细胞株、腹水和单克隆抗体半成品或成品。杂交瘤细胞株应进行细胞试验、动物抗体产生试验和鸡胚感染试验;腹水和单克隆抗体半成品或成品应进行动物抗体产生试验和鸡胚感染试验。

(1)细胞试验用的供试品  取3瓶生长良好的杂交瘤细胞,于-40℃反复冻融3次后,在无菌条件下合并分装小管,每管3ml,换上胶塞,-40℃保存。

(2)动物抗体产生试验用的供试品  单克隆抗体腹水、半成品或成品,不需处理,-20℃保存。而杂交瘤细胞按下述步骤进行处理后使用。

取7瓶生长良好的杂交瘤细胞,弃去培养液,用PBS轻轻将细胞吹打下来,移入小管,再用PBS冲洗细胞瓶,以收集残余的细胞。于小管中洗涤,以每分钟1000转离心10分钟,弃去上清液,用PBS重新悬浮细胞,以上步骤重复2次。细胞集中后,悬浮于4ml PBS中,冻融3次,超声处理。以每分钟10000转离心30分钟,吸取上清液,以每分钟40000转离心4小时,弃上清液,将沉淀溶于适量的PBS中,即为动物抗体产生试验用抗原。-40℃保存。

9.3 检查法

检查方法包括细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等。

9.3.1 1.细胞试验

用已知病毒抗体检查供试品中未知病毒抗原。

(1)细胞培养  根据被检的病毒,选择其敏感的细胞。每种细胞6瓶,细胞应生长良好。用0.01mol/LpH7.4 PBS洗细胞2次。每瓶接种供试品0.3ml,每批供试品接种4瓶,另外2瓶为对照。37℃吸附1小时,弃去吸附的供试品液体,加入细胞维持液。每天观察细胞形态,并记录结果。接种后每隔3~4天换1次液。第1代细胞应维持10~14天。冻融3次后,将对照组2瓶、供试品组4瓶分别合并。将收获的对照组和供试品组的细胞悬液分别接种同种细胞,接种后,每隔3~4天,换1次液。

(2)涂片  培养至10~14天,吸出维持液,再用PBS洗细胞2次,每瓶加消化液0.15ml,使细胞分散、脱壁,吸出细胞悬液,再用PBS洗涤2次。用适量的PBS悬浮细胞,将对照组的正常细胞涂在抗原片的第1行,供试品组的细胞涂在第2行,吹干,丙酮固定,-40℃保存,即为供试品细胞涂片。

(3)间接免疫荧光法检测  制备已知病毒抗原片,将已知特异性阳性血清和阴性血清进行1: 5~1:20的稀释;应用制备的已知病毒抗原片作为血清对照,检查供试品细胞涂片。将涂有供试品细胞的玻片,加经PBS 10倍稀释的已知阳性血清、阴性血清,置湿盒中,37℃放置30分钟后,用PBS洗涤3次,每次浸泡5分钟,待干燥后,滴加荧光抗体,37℃保温30分钟后,用PBS洗涤3次,每次浸泡5分钟,再用水洗1次,待干燥后,加50%甘油,用盖玻片封好,镜检。

(4)结果判定  在已知病毒抗原片上,阴性对照血清与正常细胞孔、病毒细胞孔无荧光,阳性对照血清与正常细胞孔无荧光,与病毒细胞孔有荧光;在供试品细胞涂片上,阴性对照血清与正常细胞孔、供试品细胞孔无荧光,阳性对照血清与正常细胞孔无荧光时,试验成立。阴性对照血清与正常细胞孔和供试品细胞孔有荧光反应或阳性对照血清与正常细胞孔有荧光反应,试验不成立。供试品细胞涂片上,阳性对照血清与供试品细胞孔有荧光,判为阳性。

9.3.2 2.动物抗体产生试验

(l)供试品抗体的制备  每批供试品按下表参数注射无特定病原体小鼠(BALB/C或KM)共50只。

动物

动物数/只

注射途径

注射剂量/ml·只-1

备注

试验组

对照组

乳鼠

10

肌内

0.03

观察4周,动物的存活率应不低于80%

3~4周龄小鼠

10

10

腹腔

0.03

观察4周,动物的存活率应不低于80%

6~8周龄小鼠

10

10

肌内和腹腔

0.1+0.2

10天后重复注射1次,14天后采血。对照组动物注射PBS

(2)血清学检查  对经肌内注射和腹腔注射的供试品组和对照组小鼠分别采血,分离血清后用ELISA法检测抗体。包被病毒抗原和正常细胞抗原,每孔0.1ml,置37℃、1小时后,放4℃过夜,用洗液充分洗涤,拍干。每份供试品分别加入病毒抗原孔和正常细胞抗原孔各1个,37℃培养1小时,用洗液充分洗涤,拍干。加酶结合物,37℃培养1小时,用洗液充分洗涤,拍干。每孔加入底物溶液0.1ml,37℃培养10~20分钟,当阳性血清对照孔出现颜色,阴性对照孔无颜色时,每孔加入1mol/L硫酸溶液0.1ml终止反应,测吸光度。

(3)结果判定  P/N值不小于2.1为阳性;

P/N值在1.5~2.0为可疑;

P/N值小于1.5为阴性。

P为供试品免疫小鼠血清与病毒抗原的吸光度减去供试品免疫小鼠血清与正常细胞抗原的吸光度;

N为对照组动物血清与病毒抗原的吸光度减去对照组动物血清与正常细胞抗原的吸光度。

9.3.3 3.鸡胚感染试验

于接种前24小时观察鸡胚。活鸡胚具有清晰的血管和鸡胚暗影,较大鸡胚还可看到胚动。死胚血管暗昏模糊,没有胚动。接种前用检卵灯再次检查鸡胚活力,并标出气室和胚胎的位置。按无菌操作要求,以卵黄囊、尿囊腔和绒毛尿囊膜途径接种供试品。接种后,每日观察,培养5天。无菌操作收集卵黄囊、绒毛尿囊膜和尿囊液。卵黄囊和绒毛尿囊膜经研磨后,离心,取上清液,与尿囊液分别用豚鼠或鸡红细胞做血凝试验。

取每排8孔微量血凝反应板,从第2孔至第8孔每孔加生理氯化钠溶液50μl。第1、2孔各加经上述处理的供试品50μl,然后从第2孔吸取50μl至第3孔,第3孔吸取50μl至第4孔(以此类推)进行倍比稀释,至第7孔时丢弃50μl。第8孔为对照孔。第1孔至第8孔各加1%;豚鼠红细胞悬液50μl,混匀。做2块反应板,分别静置于4℃和室温,至对照孔呈现明显阴性时判定结果。

结果判定:

++++  红细胞均匀铺于孔底;

+++  红细胞均匀铺于孔底,但边缘不整齐,有下滑趋向;

++  红细胞于孔底形成小环,但周围有小凝集块;

+  红细胞于孔底形成小团,边缘可见少许凝集块;

-  红细胞集中在孔底中央,呈一边缘致密的红点;

以凝集反应出现“++”,或“++”以上者判为阳性。

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10 参考资料

  1. ^ [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:第二增补本[M].北京:中国医药科技出版社,2010.
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